21  Pomiar pigmentów z osadów jeziornych: metoda spektrofotometryczna

Autor

Andrea Sanchini, Giulia Wienhues, Paul Zander, Maurycy Żarczyński

21.1 Materiały eksploatacyjne i urządzenia

21.1.1 Odczynniki chemiczne

  • Aceton 100% (klasa czystości HPLC): rozpuszczalnik.

  • Aceton techniczny: czyszczenie naczyń i urządzeń.

  • Woda redestylowana (MilliQ).

  • Azot techniczny.

  • Neodisher Laboclean.

    Neodisher LaboClean FLA: płynny, wysoko-alkaliczny środek o wysokim działaniu dyspergującym.

21.1.2 Urządzenia

  • Wyciąg laboratoryjny.
Aceton

Stężony aceton (C3H6O) to rozpuszczalnik organiczny, który wymaga pracy pod włączonym wyciągiem laboratoryjnym. Aceton jest wysoce łatwopalny. Aceton ma silne działanie drażniące.

  • Myjka ultradźwiękowa.

  • Wirówka laboratoryjna.

  • Wytrząsarka typu Vortex.

  • Piec laboratoryjny do wypiekania szkła laboratoryjnego.

  • Suszarka laboratoryjna.

  • Szklane zlewki do pipetowania acetonu.

  • Pipeta do acetonu 100–1000 µL i końcówki (odpowiednie do acetonu).

  • Pipeta do acetonu 50–250 µL i końcówki (odpowiednie do acetonu).

  • Statywy na próbki.

  • Kolby wolumetryczne (cechowane).

    1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL.

21.1.3 Pozostałe

  • Mikrokuwety 400 µL z zatyczkami.

    Kuwety łapać tylko za rogi. Upewnić się, że kuweta nie jest zanieczyszczona.

  • Długie, szklane pipety Pasteura.

    Jednorazowe.

  • Smoczek silikonowy do pipet.

21.2 Czyszczenie

  • Wymyć ręcznie szkło laboratoryjne szczotką.

  • Umyć w zmywarce laboratoryjnej.

    Program do mycia szkła i Neodisher Laboclean.

  • Wypłukać wodą redestylowaną (MilliQ) 3 razy.

  • Wyczyścić acetonem technicznym.

  • Zamknąć folią aluminiową, która uprzednio została wyczyszczona acetonem

  • Wypiec w piecu w temperaturze 292 °C.

Minimum 12 h.

21.2.1 Utylizacja

  • Aceton zgodnie z wymogami.
  • Falkony i szklane pipety Pasteura muszą zostać dokładnie umyte i wyrzucone do recyclingu.

21.3 Przygotowanie urządzenia

21.3.1 Spektrofotometr

  • Włączyć spektrofotometr i komputer.
  • Odczekać minimum 1 h przed pomiarami.
  • Włączyć oprogramowanie UVProbe.
  • Wcisnąć F4 i kliknąć Connect.
  • Ustawić parametry:

    • Zakres: 350 do 900 nm.

    • Żółty guzik ??.

    • Method: spectrum.

    • Scan speed: fast.

    • Sampling interval: 0.1 nm.

    • Scan mode: Single

    • Ok.

21.3.2 Próbki ślepe i linia bazowa

21.3.2.1 Próbka ślepa (Blank)

  • Dodać za pomocą pipety 400 µL acetonu (100%, HPLC) do kuwety.

Sprawdzić czy próbka nie jest zanieczyszczona.
Upewnić się, że w końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza.

  • Zamknąć kuwetę zatyczką

Utrudnia odparowanie próbki oraz korozję urządzenia.

  • Umieścić kuwetę w przedniej celi (cela pomiarowa).

Oznaczenie V na kuwecie powinno znajdować się z boku.

21.3.2.2 Autozero (próbka referencyjna)

  • Dodać za pomocą pipety 400 µL acetonu (100%, HPLC) do kuwety.

Sprawdzić czy próbka nie jest zanieczyszczona.
Upewnić się, że w końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza.

  • Zamknąć kuwetę zatyczką

Utrudnia odparowanie próbki oraz korozję urządzenia.

  • Umieścić kuwetę w tylnej celi (cela referencyjna).

Oznaczenie V na kuwecie powinno znajdować się z boku.

  • Kliknąć Baseline

Po tym etapie wartość absorpcji powinna wskazywać zero.
Próbka referencyjna pozostaje w celi na czas wszystkich pomiarów.

  • Wykonywać procedurę autozero przed pomiarem nowego ekstraktu.

21.3.3 Pomiar próbek

  • Ekstrakty są rozcieńczone tak, aby ogólna absorpcja mieściła się między 0.2 i 1.0 abs.

W tym zakresie oznaczenie koncentracji ma charakter liniowy i nie wymaga wykorzystania krzywych kalibracyjnych.

21.3.3.1 Rozcieńczanie

Do rozcieńczania ekstraktów można wykorzystać małą kolbę miarową lub probówki Eppendorfa. Pozwala to na ponowy pomiar próbki przy wyższym rozcieńczeniu po pipetowaniu bezpośrednio z kolby lub probówki.

21.3.3.1.1 Przykład 1:10

  • Wymieszać brązową fiolkę z ekstraktem na vortexie.

  • Za pomocą pipety przenieść 2 × 250 µL ekstraktu do kolby 5 mL.

  • Dodać aceton za pomocą szklanej pipety Pasteura do osiągnięcia 5 mL.

    Uwaga: menisk jest wklęsły.

  • Wymieszać roztwór szklaną pipetą.

21.3.3.2 Pomiar

  • Za pomocą pipety przenieść 400 µL roztworu do kuwety.

  • Zamknąć kuwetę zatyczką.

  • Umieścić kuwetę w przedniej celi (cela pomiarowa).

    Oznaczenie V na kuwecie powinno znajdować się z boku.

  • Kliknąć Start.

21.3.3.3 Zapis i eksport danych

Przy rozpoczęciu analizy pojawi się okno, w którym można wprowadzić nazwę pliku. Jednak po zakończeniu analizy każdej z próbek trzeba zapisać plik ręcznie. Inaczej dane zostaną utracone.

21.3.3.3.1 Zapis danych

File > Save as > nazwa_pliku

21.3.3.3.2 Eksport danych

Data Print

Pojawi się tabela z danymi, które należy skopiować i wkleić do arkusza kalkulacyjnego.

Należy ręcznie rozszerzyć kolumny, tak aby widoczne były pełne nazwy. W innym wypadku dane nie skopiują się odpowiednio.

21.3.3.3.3 Ewaluacja danych

Naturalne pigmenty to mieszanina barwników chlorofilowych i karotenoidów, jednak spektrum uzyskane z próbki pozwala na ocenę tego, jakie pigmenty są obecne w próbce.

Możliwe jest porównanie spektrum standardów z otrzymanymi w trakcie analizy.

21.3.3.3.3.1 Przykłady
  • Chl-a (absorption max. 430 and 663 nm)
  • Chl-b (absorption max. 463 and 648 nm)
  • Pheophytin-a (absorption max. 408 and 664nm)
  • Carotenoids (420–450 nm)
  • Bacteriochlorophyll-a (absorption max. 364 and 770 nm)
    • Bacteriopheophytin-a (absorption max. 357 and 746 nm)
  • Bacteriochlorophyll-b (absorption max. 373 and 795 nm)
    • Bacteriopheophytin-b (absorption max. 367 and 776 nm)
  • Bacteriochlorophyll-c, -d, -e (absorption max. 434, 427, 469 and 666, 655, 654 nm)
    • Bacteriopheophytin-c, -d, -e (absorption max. 412, 406, 435 and 666, 657, 665 nm)

21.4 Obliczenia fotometryczne

21.4.1 Obliczenia na potrzeby kalibracji typu proxy-proxy dla danych hiperspektralnych.

21.4.2 Korekta wartości absorpcji

Należy dokonać korekty wartości absorbcji jeśli absorbcja wynosi więcej lub mniej niż 0 pomiędzy 720 nm i 900 nm. Wartości przeskalować tak aby uzyskać 0 w zakresie 720 nm i 900 nm.

  • Do określenia zawartości całkowitych karotenoidów i chloropigmentów, przy absencji bakteriochloropigmentów w próbce, można wykorzystać wartości absorbcji odpowiadające długości fali 750 nm.

  • W przypadku obecności bakteriochloropigmentów w próbce, należy znaleźć odpowiednią wartość dla wybranej długości fali powyżej 750 nm i wykorzystać do przeskalowania wyników.

Procedura opisana w artykule Sanchini i Grosjean (2020).

21.4.3 Obliczenia całkowitych chloropigmentów-a oraz bakteriofeofityny-a ze spektrów absorpcji

Koncentracje oblicza się z wykorzystaniem wzoru

\[ c = A_λ / (α_λ × l) \]

gdzie:

l: szerokość kuwety (cm);

Aλ: zmierzona absorbcja odpowiadająca wybranej długości fali;

αλ: molowy współczynnik ekstynkcji wynoszący 88.77 × 10-3 × L × cm-1 × mg-1 dla chloropigmentów-a przy długości fali 666 nm (Jeffrey and Humphrey, 1975) oraz 52.855 × 10-3 × L × cm-1 × mg-1 dla bakteriofeofityny-a przy długości fali 750 nm (Fiedor et al., 2002).

Wynik to koncentracja zmierzona w kuwecie (mg/l), który należy skorygować odpowiednio do rozcieńczenia oraz wagi próbki.

Przykładowe obliczenia zebrane zostały w arkuszu Spectrophotometer_calculator.xlsx

\[ (absorbcja piku) / k × (wspóczynnik rozcieńczenia) × (waga próbki) / (obejętość ektraktu) \]

gdzie:

k: stała, 0.080770 dla chloropigmentów przy piku o długości fali 666 nm (Jeffrey and Humphrey, 1975) i 0.052855 dla bakteriofeofityny przy piku dla długości fali 750 nm (Fiedor et al., 2002).

21.4.4 Obliczenia choloroflu a, b i c ze spektrów absorpcji

21.4.5 Obliczenia całkowitych karotenoidów ze spektrów absorpcji

21.4.5.1 Za Lichtenthaler and Buschmann (2001)

W ekstrakcie materiału roślinnego zawierającym karotenoidy (x + c = xanatofile i karoteny) w dodatku do chlorofili, A470 (region karotenoidów) oznacza się jako sumę absorbcji dla chlorofilu-a, chlorofilu-b oraz karotenoidów:

  • Aceton (czysty, 100%):

\[ c_{(x + c)} = (1000 × A_{470} - 1.90_{C_a} – 63.14_{C_b}) / 214 \]

Aceton (20% wody):

\[ c_{(x + c)} = (1000 × A_{470} - 1.82_{C_a} – 85.02_{C_b}) / 198 \]

gdzie:

A470: absorbcja dla długości fali 470 nm;

Ca: xxx

Cb: xxx

21.4.5.2 Za Guilizzoni et al. (2011); na podstawie Züllig et al. (1981)

Całkowite karotenoidy wyrażone są jako mg TC (total carotenoids) na gram suchej materii organicznej (gLOI).

\[ TC = ((E_{450} - 0.8 × E_{665}) × V × 10) / E^{1\%}_{1cm} × g_{LOI} \]

gdzie:

Exxx: gęstość optyczna w kuwecie o ścieżce optycznej 1 cm (szerokość) dla długości fali 450 nm i 665 nm, skorygowanych o gęstość optyczną dla długości fali 750 nm;

V: objętość ekstraktu;

E1%1cm: średni współczynnik ekstynkcji dla 1% roztworu ekstraktu z osadów (wagowo) dla karotenoidów przy ścieżce optycznej (szerokość) 1 cm. Równe 2.250 (Züllig 1981; Leavitt and Hodgson 2001);

E450: główne pasmo absorbcji dla karotenoidów w zakresie widzialnym;

E665: korekta na przybliżone pasmo absorbcji chlorofili i pochodnych chlorofili odpowiadające długości fali 665 nm;

gLOI: równoważnik strat na prażeniu dla mokrego osadu, obliczony na podstawie zawartości osadów i suchej masy po LOI.

21.4.6 Funkcja transferu dla fosforu całkowitego

21.5 Rejestr zmian

  • 09.12.2022 MZ: wersja inicjalna Quarto, procedura za: Paul Zander, Andrea Sanchini i Giulia Wienhues (Uniwersytet w Bernie).
  • 09.02.2023 MZ: pełna wersja.
  • 29.05.2023 MZ: Quarto book chapter.