21 Pomiar pigmentów z osadów jeziornych: metoda spektrofotometryczna
21.1 Materiały eksploatacyjne i urządzenia
21.1.1 Odczynniki chemiczne
Aceton 100% (klasa czystości HPLC): rozpuszczalnik.
Aceton techniczny: czyszczenie naczyń i urządzeń.
Woda redestylowana (MilliQ).
Azot techniczny.
Neodisher Laboclean.
Neodisher LaboClean FLA: płynny, wysoko-alkaliczny środek o wysokim działaniu dyspergującym.
21.1.2 Urządzenia
- Wyciąg laboratoryjny.
Stężony aceton (C3H6O) to rozpuszczalnik organiczny, który wymaga pracy pod włączonym wyciągiem laboratoryjnym. Aceton jest wysoce łatwopalny. Aceton ma silne działanie drażniące.
Myjka ultradźwiękowa.
Wirówka laboratoryjna.
Wytrząsarka typu Vortex.
Piec laboratoryjny do wypiekania szkła laboratoryjnego.
Suszarka laboratoryjna.
Szklane zlewki do pipetowania acetonu.
Pipeta do acetonu 100–1000 µL i końcówki (odpowiednie do acetonu).
Pipeta do acetonu 50–250 µL i końcówki (odpowiednie do acetonu).
Statywy na próbki.
Kolby wolumetryczne (cechowane).
1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL.
21.1.3 Pozostałe
Mikrokuwety 400 µL z zatyczkami.
Kuwety łapać tylko za rogi. Upewnić się, że kuweta nie jest zanieczyszczona.
Długie, szklane pipety Pasteura.
Jednorazowe.
Smoczek silikonowy do pipet.
21.2 Czyszczenie
Wymyć ręcznie szkło laboratoryjne szczotką.
Umyć w zmywarce laboratoryjnej.
Program do mycia szkła i Neodisher Laboclean.
Wypłukać wodą redestylowaną (MilliQ) 3 razy.
Wyczyścić acetonem technicznym.
Zamknąć folią aluminiową, która uprzednio została wyczyszczona acetonem
Wypiec w piecu w temperaturze 292 °C.
Minimum 12 h.
21.2.1 Utylizacja
- Aceton zgodnie z wymogami.
- Falkony i szklane pipety Pasteura muszą zostać dokładnie umyte i wyrzucone do recyclingu.
21.3 Przygotowanie urządzenia
21.3.1 Spektrofotometr
- Włączyć spektrofotometr i komputer.
- Odczekać minimum 1 h przed pomiarami.
- Włączyć oprogramowanie UVProbe.
- Wcisnąć
F4i kliknąćConnect. - Ustawić parametry:
Zakres: 350 do 900 nm.
Żółty guzik ??.
Method: spectrum.
Scan speed: fast.
Sampling interval: 0.1 nm.
Scan mode: Single
Ok.
21.3.2 Próbki ślepe i linia bazowa
21.3.2.1 Próbka ślepa (Blank)
- Dodać za pomocą pipety 400 µL acetonu (100%, HPLC) do kuwety.
Sprawdzić czy próbka nie jest zanieczyszczona.
Upewnić się, że w końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza.
- Zamknąć kuwetę zatyczką
Utrudnia odparowanie próbki oraz korozję urządzenia.
- Umieścić kuwetę w przedniej celi (cela pomiarowa).
Oznaczenie V na kuwecie powinno znajdować się z boku.
21.3.2.2 Autozero (próbka referencyjna)
- Dodać za pomocą pipety 400 µL acetonu (100%, HPLC) do kuwety.
Sprawdzić czy próbka nie jest zanieczyszczona.
Upewnić się, że w końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza.
- Zamknąć kuwetę zatyczką
Utrudnia odparowanie próbki oraz korozję urządzenia.
- Umieścić kuwetę w tylnej celi (cela referencyjna).
Oznaczenie V na kuwecie powinno znajdować się z boku.
- Kliknąć
Baseline
Po tym etapie wartość absorpcji powinna wskazywać zero.
Próbka referencyjna pozostaje w celi na czas wszystkich pomiarów.
- Wykonywać procedurę autozero przed pomiarem nowego ekstraktu.
21.3.3 Pomiar próbek
- Ekstrakty są rozcieńczone tak, aby ogólna absorpcja mieściła się między 0.2 i 1.0 abs.
W tym zakresie oznaczenie koncentracji ma charakter liniowy i nie wymaga wykorzystania krzywych kalibracyjnych.
21.3.3.1 Rozcieńczanie
Do rozcieńczania ekstraktów można wykorzystać małą kolbę miarową lub probówki Eppendorfa. Pozwala to na ponowy pomiar próbki przy wyższym rozcieńczeniu po pipetowaniu bezpośrednio z kolby lub probówki.
21.3.3.1.1 Przykład 1:10
Wymieszać brązową fiolkę z ekstraktem na vortexie.
Za pomocą pipety przenieść 2 × 250 µL ekstraktu do kolby 5 mL.
Dodać aceton za pomocą szklanej pipety Pasteura do osiągnięcia 5 mL.
Uwaga: menisk jest wklęsły.
Wymieszać roztwór szklaną pipetą.
21.3.3.2 Pomiar
Za pomocą pipety przenieść 400 µL roztworu do kuwety.
Zamknąć kuwetę zatyczką.
Umieścić kuwetę w przedniej celi (cela pomiarowa).
Oznaczenie V na kuwecie powinno znajdować się z boku.
Kliknąć
Start.
21.3.3.3 Zapis i eksport danych
Przy rozpoczęciu analizy pojawi się okno, w którym można wprowadzić nazwę pliku. Jednak po zakończeniu analizy każdej z próbek trzeba zapisać plik ręcznie. Inaczej dane zostaną utracone.
21.3.3.3.1 Zapis danych
File > Save as > nazwa_pliku
21.3.3.3.2 Eksport danych
Data Print
Pojawi się tabela z danymi, które należy skopiować i wkleić do arkusza kalkulacyjnego.
Należy ręcznie rozszerzyć kolumny, tak aby widoczne były pełne nazwy. W innym wypadku dane nie skopiują się odpowiednio.
21.3.3.3.3 Ewaluacja danych
Naturalne pigmenty to mieszanina barwników chlorofilowych i karotenoidów, jednak spektrum uzyskane z próbki pozwala na ocenę tego, jakie pigmenty są obecne w próbce.
Możliwe jest porównanie spektrum standardów z otrzymanymi w trakcie analizy.
21.3.3.3.3.1 Przykłady
- Chl-a (absorption max. 430 and 663 nm)
- Chl-b (absorption max. 463 and 648 nm)
- Pheophytin-a (absorption max. 408 and 664nm)
- Carotenoids (420–450 nm)
- Bacteriochlorophyll-a (absorption max. 364 and 770 nm)
- Bacteriopheophytin-a (absorption max. 357 and 746 nm)
- Bacteriochlorophyll-b (absorption max. 373 and 795 nm)
- Bacteriopheophytin-b (absorption max. 367 and 776 nm)
- Bacteriochlorophyll-c, -d, -e (absorption max. 434, 427, 469 and 666, 655, 654 nm)
- Bacteriopheophytin-c, -d, -e (absorption max. 412, 406, 435 and 666, 657, 665 nm)
21.4 Obliczenia fotometryczne
21.4.1 Obliczenia na potrzeby kalibracji typu proxy-proxy dla danych hiperspektralnych.
21.4.2 Korekta wartości absorpcji
Należy dokonać korekty wartości absorbcji jeśli absorbcja wynosi więcej lub mniej niż 0 pomiędzy 720 nm i 900 nm. Wartości przeskalować tak aby uzyskać 0 w zakresie 720 nm i 900 nm.
Do określenia zawartości całkowitych karotenoidów i chloropigmentów, przy absencji bakteriochloropigmentów w próbce, można wykorzystać wartości absorbcji odpowiadające długości fali 750 nm.
W przypadku obecności bakteriochloropigmentów w próbce, należy znaleźć odpowiednią wartość dla wybranej długości fali powyżej 750 nm i wykorzystać do przeskalowania wyników.
Procedura opisana w artykule Sanchini i Grosjean (2020).
21.4.3 Obliczenia całkowitych chloropigmentów-a oraz bakteriofeofityny-a ze spektrów absorpcji
Koncentracje oblicza się z wykorzystaniem wzoru
\[ c = A_λ / (α_λ × l) \]
gdzie:
l: szerokość kuwety (cm);
Aλ: zmierzona absorbcja odpowiadająca wybranej długości fali;
αλ: molowy współczynnik ekstynkcji wynoszący 88.77 × 10-3 × L × cm-1 × mg-1 dla chloropigmentów-a przy długości fali 666 nm (Jeffrey and Humphrey, 1975) oraz 52.855 × 10-3 × L × cm-1 × mg-1 dla bakteriofeofityny-a przy długości fali 750 nm (Fiedor et al., 2002).
Wynik to koncentracja zmierzona w kuwecie (mg/l), który należy skorygować odpowiednio do rozcieńczenia oraz wagi próbki.
Przykładowe obliczenia zebrane zostały w arkuszu Spectrophotometer_calculator.xlsx
\[ (absorbcja piku) / k × (wspóczynnik rozcieńczenia) × (waga próbki) / (obejętość ektraktu) \]
gdzie:
k: stała, 0.080770 dla chloropigmentów przy piku o długości fali 666 nm (Jeffrey and Humphrey, 1975) i 0.052855 dla bakteriofeofityny przy piku dla długości fali 750 nm (Fiedor et al., 2002).
21.4.4 Obliczenia choloroflu a, b i c ze spektrów absorpcji
21.4.5 Obliczenia całkowitych karotenoidów ze spektrów absorpcji
21.4.5.1 Za Lichtenthaler and Buschmann (2001)
W ekstrakcie materiału roślinnego zawierającym karotenoidy (x + c = xanatofile i karoteny) w dodatku do chlorofili, A470 (region karotenoidów) oznacza się jako sumę absorbcji dla chlorofilu-a, chlorofilu-b oraz karotenoidów:
- Aceton (czysty, 100%):
\[ c_{(x + c)} = (1000 × A_{470} - 1.90_{C_a} – 63.14_{C_b}) / 214 \]
Aceton (20% wody):
\[ c_{(x + c)} = (1000 × A_{470} - 1.82_{C_a} – 85.02_{C_b}) / 198 \]
gdzie:
A470: absorbcja dla długości fali 470 nm;
Ca: xxx
Cb: xxx
21.4.5.2 Za Guilizzoni et al. (2011); na podstawie Züllig et al. (1981)
Całkowite karotenoidy wyrażone są jako mg TC (total carotenoids) na gram suchej materii organicznej (gLOI).
\[ TC = ((E_{450} - 0.8 × E_{665}) × V × 10) / E^{1\%}_{1cm} × g_{LOI} \]
gdzie:
Exxx: gęstość optyczna w kuwecie o ścieżce optycznej 1 cm (szerokość) dla długości fali 450 nm i 665 nm, skorygowanych o gęstość optyczną dla długości fali 750 nm;
V: objętość ekstraktu;
E1%1cm: średni współczynnik ekstynkcji dla 1% roztworu ekstraktu z osadów (wagowo) dla karotenoidów przy ścieżce optycznej (szerokość) 1 cm. Równe 2.250 (Züllig 1981; Leavitt and Hodgson 2001);
E450: główne pasmo absorbcji dla karotenoidów w zakresie widzialnym;
E665: korekta na przybliżone pasmo absorbcji chlorofili i pochodnych chlorofili odpowiadające długości fali 665 nm;
gLOI: równoważnik strat na prażeniu dla mokrego osadu, obliczony na podstawie zawartości osadów i suchej masy po LOI.
21.4.6 Funkcja transferu dla fosforu całkowitego
21.5 Rejestr zmian
- 09.12.2022 MZ: wersja inicjalna Quarto, procedura za: Paul Zander, Andrea Sanchini i Giulia Wienhues (Uniwersytet w Bernie).
- 09.02.2023 MZ: pełna wersja.
- 29.05.2023 MZ: Quarto book chapter.